細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)如何適應(yīng)無血清培養(yǎng)基？

第一種方法是連續(xù)適應(yīng)/循序隔絕法。通過一系列的血清還原步驟，使細(xì)胞適應(yīng)無血清培養(yǎng)基。這是優(yōu)先選用的方法，且不對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境形成太過惡劣的變化。

連續(xù)適應(yīng)/循序隔絕法——方法1

使原培養(yǎng)基內(nèi)的細(xì)胞連續(xù)地經(jīng)過以下幾個(gè)階段：

階段1：75%補(bǔ)加血清的培養(yǎng)基或25%無血清培養(yǎng)基

階段2：50%補(bǔ)加血清的培養(yǎng)基或50%無血清培養(yǎng)基

階段3：25%補(bǔ)加血清的培養(yǎng)基或75%無血清培養(yǎng)基

階段4:100%無血清培養(yǎng)基

連續(xù)適應(yīng)/循序隔絕法——方法2

1、以原培養(yǎng)基中的相同濃度，將血清加入無血清培養(yǎng)基內(nèi)。將細(xì)胞從含血清的原培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到加了血清的無血清培養(yǎng)基，此時(shí)應(yīng)注意要提高新培養(yǎng)系統(tǒng)中的細(xì)胞密度。讓細(xì)胞有一個(gè)適應(yīng)過渡期。

2、按照方法1，緩慢地降低血清濃度，使細(xì)胞在每個(gè)階段有適應(yīng)的時(shí)間。

3、一旦血清補(bǔ)加量降為0，在用于進(jìn)行分析或其他操作前，讓細(xì)胞培養(yǎng)物具有數(shù)個(gè)適應(yīng)過渡期。

另一種方法是直接適應(yīng)。其中，細(xì)胞直接從含血清培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到無血清培養(yǎng)基內(nèi)。將大量細(xì)胞直接轉(zhuǎn)移到無血清或無蛋白的新培養(yǎng)基內(nèi)。細(xì)胞必須處于指數(shù)生長(zhǎng)期中期，且存活率>90%。

每3到4天更換約50%的培養(yǎng)基，以防止培養(yǎng)基變成酸性。維持高于正常值的細(xì)胞培養(yǎng)密度，直至培養(yǎng)的細(xì)胞需要每日更換培養(yǎng)基。這時(shí)，將細(xì)胞擴(kuò)增到多個(gè)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。

考慮建議

請(qǐng)?jiān)谶m應(yīng)過程中，細(xì)胞通常對(duì)PH和溫度變化較為敏感。讓細(xì)胞在每個(gè)階段都至少有一個(gè)適應(yīng)過渡期。

細(xì)胞存活率和細(xì)胞密度

細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期快速分裂，且在適應(yīng)過程開始時(shí)，存活率大于90%。這一點(diǎn)至關(guān)重要。當(dāng)細(xì)胞需傳代時(shí)，建議采用1:2或1:3的小傳代比例，以維持更高的細(xì)胞密度，同時(shí)提供隔絕期間可能有助于細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)因子。當(dāng)細(xì)胞適應(yīng)新的培養(yǎng)條件時(shí)，在增大細(xì)胞傳代密度。

細(xì)胞生長(zhǎng)

如果在適應(yīng)過程中，細(xì)胞停止了生長(zhǎng)，則需讓細(xì)胞有更多的時(shí)間來適應(yīng)培養(yǎng)基組合。例如，在方法1的階段4，向無血清培養(yǎng)基添加少量的血清(1-3%)。這樣有助于細(xì)胞更容易地適應(yīng)新的培養(yǎng)基。然后，在幾個(gè)過渡期內(nèi)，緩慢地減少血清量，直至學(xué)清量為0。

懸浮培養(yǎng)物

Meiatech公司的無血清培養(yǎng)基和無蛋白培養(yǎng)基不含血清中所發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞附著延伸影子。在一段過渡期內(nèi)，貼壁細(xì)胞將開始離開表面，并成為懸浮細(xì)胞系開始生長(zhǎng)。細(xì)胞也可能因適應(yīng)而發(fā)生形態(tài)變化。監(jiān)測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)速度，只要細(xì)胞能夠與新系統(tǒng)相融合，任何形態(tài)變化都不重要。

細(xì)胞叢

在適應(yīng)于無血清培養(yǎng)期間，細(xì)胞容易形成叢。傳代培養(yǎng)時(shí)，將叢輕輕折斷，使其分散開。將培養(yǎng)物從靜止細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)轉(zhuǎn)移到可旋轉(zhuǎn)錐形瓶?jī)?nèi)，這樣可能會(huì)有助于防止細(xì)胞叢的形成。

抗生素

由于血清蛋白易于粘合到抗生素上，因此，不建議在無血清適應(yīng)過程中使用抗生素。如不存在血清蛋白，則抗生素水平可能會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。

預(yù)防措施

確保在開始適應(yīng)過程前，儲(chǔ)存有大量原培養(yǎng)基的細(xì)胞。如果細(xì)胞沒有存活到下一階段，則在整個(gè)過程中保存每一階段使用的培養(yǎng)瓶。