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★CQ★現(xiàn)象描述:

我昨天早上傳的代，晚上看還是好好的，培養(yǎng)基顏色正常，今天早上9點(diǎn)鐘左右，培養(yǎng)基就變渾濁了，顯微鏡下觀察細(xì)胞好多都已經(jīng)漂起來了，明顯是污染了，但我的培養(yǎng)液里明明加了雙抗了啊？

這個問題等同于，

明明有免疫系統(tǒng)的我們

為什么還是感冒了呢

★CQ★解答一

>> 加雙抗只是有一定的預(yù)防作用，但不能避免污染

現(xiàn)在很多細(xì)菌對雙抗都有耐藥性，所以加了也不一定就能殺死；雙抗的保存方式的問題，青霉素在37℃下很快就會分解掉；污染的細(xì)菌是不是在抗菌譜中；如果是真菌的話雙抗就沒有什么卵用的；

★CQ★解答二

>> 養(yǎng)細(xì)胞要從源頭做起，杜絕各種污染

剛買來的或借來的細(xì)胞株，一般都會在培養(yǎng)基中添加抗生素，待通過污染測試后，大量培養(yǎng)時則不要加抗生素；

還有就是無血清培養(yǎng)時建議zuihao不加雙抗，因為沒有血清的保護(hù)，細(xì)胞此時是比較脆弱的，很容易受到雙抗的毒副作用影響。

加雙抗并不是*除菌的方法。要防止污染除了使用雙抗，還要注意污染源大多來自換液和消化時的操作不正規(guī)，如果你在處理細(xì)胞得操作過程不規(guī)范，即便加入雙抗也很難避免污染。就像抵抗力再強(qiáng)的漢紙，如果任由自己在寒風(fēng)中、雨雪天氣里任性，像一顆海草隨風(fēng)飄搖的話，終有崩潰的一天。所以保證細(xì)胞處理過程或培養(yǎng)基配制過程中的無菌操作才是關(guān)鍵。

★CQ★解答三

>> 不是所有的細(xì)胞污染都用相同的解決辦法

很多實驗室在遇到細(xì)胞污染，準(zhǔn)確的說是懷疑細(xì)胞受到污染（原因不明導(dǎo)致的細(xì)胞狀態(tài)不好）時，都會選擇一種處理方式——扔掉！害怕他會傳染到其他的細(xì)胞，但是往往你們?nèi)拥舻氖?ldquo;受害者”，而沒找到“真兇”。

并不是所有的細(xì)胞污染都能用扔掉解決，也并不是所有的細(xì)胞污染都可以用同一種試劑解決。

辨別細(xì)胞狀態(tài)，找到根源，“對癥下藥”才是關(guān)鍵。

（1）細(xì)菌污染 

狀態(tài)：細(xì)菌在普通倒置顯微鏡下為黑色細(xì)沙狀，根據(jù)感染細(xì)菌的不同，可有不同的外形，培養(yǎng)液一般會渾濁變黃，對細(xì)胞生長影響明顯。 

解決方法： 

1.仔細(xì)檢查一下器皿的滅菌情況，是否在高壓滅菌時放氣時間和壓力足夠！尤其是和儲存培養(yǎng)液接觸的移液管等物品，連續(xù)兩次污染的話有可能造成儲存液污染，一定要檢查培養(yǎng)液是否存在渾濁現(xiàn)象！ 

2.可在培養(yǎng)液或血清中加支原體預(yù)防劑，以及的細(xì)菌清除劑。 

（2）霉菌及真菌污染 

狀態(tài)：肉眼觀察培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基顏色基本無變化，不渾濁，但是培養(yǎng)基中由絮狀漂浮物，顯微鏡下觀察，若感染真菌可看到分叉細(xì)絲狀的結(jié)構(gòu)（不同種類結(jié)構(gòu)不同），若感染霉菌，顯微鏡下可看到片狀的結(jié)構(gòu)，不透明，真菌及霉菌對影響細(xì)胞的生長影響不大。 

解決方法： 

1.保證細(xì)胞房的干凈整潔，干燥的環(huán)境(潮濕的環(huán)境利于霉菌及真菌的生長)。 

2.控制外來人員進(jìn)出實驗室。 

3.對實驗室及培養(yǎng)箱進(jìn)行*消毒，推薦使用專門針對細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的抑菌劑。 

4.若細(xì)胞非常珍貴，且不易獲得，可以對污染的細(xì)胞采取如下操作。 

懸浮細(xì)胞：收集細(xì)胞并離心，用PBS漂洗，重復(fù)此操作數(shù)次。貼壁細(xì)胞：用PBS輕輕沖洗細(xì)胞，重復(fù)此操作數(shù)次。加入殺滅真菌

（3）支原體感染 

狀態(tài)：顯微鏡下很難捕捉，培養(yǎng)液一般不會渾濁，國內(nèi)血清很多沒做支原體陰性檢測，而支原體是牛血清中zui常見的微生物之一。而且它不能用過濾的辦法除去。支原體感染細(xì)胞以后，細(xì)胞病變不很明顯，只是生長緩慢，直至慢慢凋亡。 

解決方法： 

>>預(yù)防：實驗室新購買的血清及培養(yǎng)基需檢測是否含有支原體，引進(jìn)的新品種細(xì)胞需做支原體檢測，向培養(yǎng)基中添加支原體預(yù)防劑。 

>>補(bǔ)救：將支原體去除劑與*培養(yǎng)液按1:800～1000比例稀釋，加入細(xì)胞正常培養(yǎng)；并根據(jù)細(xì)胞污染的嚴(yán)重程度，處理3～6次即可*清除細(xì)胞支原體污染問題。 

（4）黑膠蟲污染 

狀態(tài)：可以穿透濾膜，也可以通過空氣傳播，低倍下為黑色點(diǎn)狀，高倍鏡下可看見黑色的小蟲游來游去，培養(yǎng)液不渾濁，一般不會太影響，細(xì)胞還可以用。常常可在同一批號的血清養(yǎng)的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。

解決方法：

加入黑膠蟲去除劑，改變培養(yǎng)基的品牌。血清凍融采取逐級凍融等方法。

（5）桿菌污染

狀態(tài)：類芽孢桿菌（Paenibacillus Ash,Priest&Collin,1994）呈桿狀，革蘭氏染色陽性、陰性或可變，以周生鞭毛運(yùn)動。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)類芽孢桿菌污染，會在顯微鏡下看到一些桿狀游動的小蟲子.

解決方法：

a. 發(fā)現(xiàn)細(xì)胞有桿菌污染，棄掉培養(yǎng)基，用PBS清洗3遍；

b. 然后按1:2000 比例加入類芽孢桿菌去除劑，即：邊加邊搖勻；

c. 每天處理一次，類芽孢桿菌去除劑連續(xù)處理3-4天，即可*清除桿菌污染。

除以上污染源外，配液消毒問題、操作問題也是污染原因之一。關(guān)于培養(yǎng)基的無菌狀況，取培養(yǎng)基至培養(yǎng)瓶中（不加細(xì)胞），37℃試培養(yǎng)一段時間后觀察，如果沒有細(xì)菌生長就是操作及細(xì)胞培養(yǎng)箱環(huán)境的問題。

★CQ★細(xì)胞培養(yǎng)，尤其是細(xì)胞系的培養(yǎng)，就細(xì)胞消化而言，多做、善于總結(jié)，就可以把細(xì)胞養(yǎng)的越來越好。

★CQ★絕大部分細(xì)胞消化只要用胰酶潤洗一遍即可：

吸去胰酶后，殘留的那些無法計算體積的附著在細(xì)胞表面的微量胰酶在37度一般不到2min足夠消化細(xì)胞（絕大部分1min不到）。對于這些細(xì)胞原則上不要用胰酶孵育細(xì)胞，連續(xù)這樣傳代，對細(xì)胞傷害很大。簡單的程序是PBS潤洗吸去，胰酶潤洗吸去，然后37度消化。

★CQ★什么算是消化好了呢？

不需要把細(xì)胞全部消化成間隔分布很離散的單個圓形才算消化好了，一般你肉眼觀察貼壁細(xì)胞層，只要能移動了，多半呈沙壯移動，其實已經(jīng)可以了。

一般能移動了，說明細(xì)胞與培養(yǎng)基質(zhì)材料的附著已經(jīng)消失了，細(xì)胞之間的附著也已經(jīng)消失了，細(xì)胞已經(jīng)獨(dú)立分布了（雖然沒有呈現(xiàn)很廣的離散分布）。這個時候應(yīng)該停止消化，不要等到看到鏡下所有細(xì)胞都分離得非常好，間隙很大，才停止。

細(xì)胞就是*成單個細(xì)胞懸液，之后在貼壁的過程中仍然會聚集，這個是貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，尤其是腫瘤細(xì)胞的一個特性，你可以嘗試，準(zhǔn)備100%的單個細(xì)胞懸液，貼壁后觀察細(xì)胞，仍然是幾個幾個細(xì)胞聚集在一起。

一些懸浮培養(yǎng)細(xì)胞也是如此，容易聚集，不要過幾個小時就拿出來吹打成單細(xì)胞懸液。細(xì)胞只要能從基質(zhì)上脫離下來，即使是成片的（比如Calu-3細(xì)胞），吹打不超過20次（一般10次即可），成小規(guī)模聚集（10個細(xì)胞左右）是正常的，不要再去延長消化時間，等待單細(xì)胞懸液出現(xiàn)。

★CQ★比較難消化的細(xì)胞：

潤洗方法5min還不能消化，以結(jié)腸癌細(xì)胞為例，比如HCT15、LS411和KM12細(xì)胞，胰酶消化，一般10 cm 培養(yǎng)皿，一次zui多加入300ul-500ul就足夠了。即使這樣難消化的細(xì)胞，一般不超過5min，即可見細(xì)胞成片移動，就應(yīng)該停止消化。一些正常細(xì)胞也會有難消化的時候，比如tsDC細(xì)胞，用胰酶孵育，3min左右即可看到成片沙狀移動。

★CQ★常規(guī)的細(xì)胞實驗，受消化影響不是很大：

如果不用胰酶去孵育而使用潤洗的方法消化的話（難消化細(xì)胞例外）。但少數(shù)實驗，比如病毒包裝，對細(xì)胞代數(shù)，對細(xì)胞狀態(tài)要求*。這個時候，胰酶消化，就是潤洗，都會對細(xì)胞包裝病毒的能力有影響，傳代次數(shù)一多，細(xì)胞包裝能力就會逐漸下降。這個時候都不用胰酶消化，用一些鹽溶液（不是EDTA液）即可。這些鹽溶液通過影響細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)酶的活性，來使得細(xì)胞脫離基質(zhì)附著表面，但不切割任何蛋白。

★CQ★EDTA的作用：

許多人不用胰酶，只用EDTA，或者用胰酶/EDTA聯(lián)合作用。這里要明白，胰酶切割細(xì)胞外基質(zhì)的一些負(fù)責(zé)粘連和附著的蛋白，而EDTA通過螯合Ca離子，作用于整聯(lián)蛋白的活性，所以EDTA的作用更加溫和。有的人在胰酶里添加一些EDTA，或者對付特別難消化的細(xì)胞，添加多一些EDTA，就是這個道理。一般不要試圖延長消化時間（如果10min還消化不*的話），而應(yīng)該想其它辦法。

★CQ★PBS洗滌：

消化之前用PBS洗滌，是常見的操作，因為血清中含有抑制胰酶的蛋白。對于一些難消化細(xì)胞，可以配制不含Ca，Mg離子的PBS，因為這些離子也會抑制胰酶的活性。但對于絕大部分細(xì)胞用胰酶或者EDTA溶液潤洗即可消化，不需要配制不含Ca，Mg離子的溶液。

每段時間定期對細(xì)胞房、培養(yǎng)箱&水盤、水浴鍋、廢液桶等容易染菌的個角落細(xì)菌、真菌等微生物的清除，每次操作完都整理好細(xì)胞房，帶好手套、口罩、鞋套，防止人為因素污染。一旦發(fā)現(xiàn)污染，及時處理。

★CQ★細(xì)胞培養(yǎng)，尤其是細(xì)胞系的培養(yǎng)，就細(xì)胞消化而言，多做、善于總結(jié)，就可以把細(xì)胞養(yǎng)的越來越好。

★CQ★絕大部分細(xì)胞消化只要用胰酶潤洗一遍即可：

吸去胰酶后，殘留的那些無法計算體積的附著在細(xì)胞表面的微量胰酶在37度一般不到2min足夠消化細(xì)胞（絕大部分1min不到）。對于這些細(xì)胞原則上不要用胰酶孵育細(xì)胞，連續(xù)這樣傳代，對細(xì)胞傷害很大。簡單的程序是PBS潤洗吸去，胰酶潤洗吸去，然后37度消化。

★CQ★什么算是消化好了呢？

不需要把細(xì)胞全部消化成間隔分布很離散的單個圓形才算消化好了，一般你肉眼觀察貼壁細(xì)胞層，只要能移動了，多半呈沙壯移動，其實已經(jīng)可以了。

一般能移動了，說明細(xì)胞與培養(yǎng)基質(zhì)材料的附著已經(jīng)消失了，細(xì)胞之間的附著也已經(jīng)消失了，細(xì)胞已經(jīng)獨(dú)立分布了（雖然沒有呈現(xiàn)很廣的離散分布）。這個時候應(yīng)該停止消化，不要等到看到鏡下所有細(xì)胞都分離得非常好，間隙很大，才停止。

細(xì)胞就是*成單個細(xì)胞懸液，之后在貼壁的過程中仍然會聚集，這個是貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，尤其是腫瘤細(xì)胞的一個特性，你可以嘗試，準(zhǔn)備100%的單個細(xì)胞懸液，貼壁后觀察細(xì)胞，仍然是幾個幾個細(xì)胞聚集在一起。

一些懸浮培養(yǎng)細(xì)胞也是如此，容易聚集，不要過幾個小時就拿出來吹打成單細(xì)胞懸液。細(xì)胞只要能從基質(zhì)上脫離下來，即使是成片的（比如Calu-3細(xì)胞），吹打不超過20次（一般10次即可），成小規(guī)模聚集（10個細(xì)胞左右）是正常的，不要再去延長消化時間，等待單細(xì)胞懸液出現(xiàn)。

★CQ★比較難消化的細(xì)胞：

潤洗方法5min還不能消化，以結(jié)腸癌細(xì)胞為例，比如HCT15、LS411和KM12細(xì)胞，胰酶消化，一般10 cm 培養(yǎng)皿，一次zui多加入300ul-500ul就足夠了。即使這樣難消化的細(xì)胞，一般不超過5min，即可見細(xì)胞成片移動，就應(yīng)該停止消化。一些正常細(xì)胞也會有難消化的時候，比如tsDC細(xì)胞，用胰酶孵育，3min左右即可看到成片沙狀移動。

★CQ★常規(guī)的細(xì)胞實驗，受消化影響不是很大：

如果不用胰酶去孵育而使用潤洗的方法消化的話（難消化細(xì)胞例外）。但少數(shù)實驗，比如病毒包裝，對細(xì)胞代數(shù)，對細(xì)胞狀態(tài)要求*。這個時候，胰酶消化，就是潤洗，都會對細(xì)胞包裝病毒的能力有影響，傳代次數(shù)一多，細(xì)胞包裝能力就會逐漸下降。這個時候都不用胰酶消化，用一些鹽溶液（不是EDTA液）即可。這些鹽溶液通過影響細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)酶的活性，來使得細(xì)胞脫離基質(zhì)附著表面，但不切割任何蛋白。

★CQ★EDTA的作用：

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★CQ★PBS洗滌：

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每段時間定期對細(xì)胞房、培養(yǎng)箱&水盤、水浴鍋、廢液桶等容易染菌的個角落細(xì)菌、真菌等微生物的清除，每次操作完都整理好細(xì)胞房，帶好手套、口罩、鞋套，防止人為因素污染。一旦發(fā)現(xiàn)污染，及時處理。

★CQ★解答一

>> 加雙抗只是有一定的預(yù)防作用，但不能避免污染

現(xiàn)在很多細(xì)菌對雙抗都有耐藥性，所以加了也不一定就能殺死；雙抗的保存方式的問題，青霉素在37℃下很快就會分解掉；污染的細(xì)菌是不是在抗菌譜中；如果是真菌的話雙抗就沒有什么卵用的；

★CQ★解答二

>> 養(yǎng)細(xì)胞要從源頭做起，杜絕各種污染

剛買來的或借來的細(xì)胞株，一般都會在培養(yǎng)基中添加抗生素，待通過污染測試后，大量培養(yǎng)時則不要加抗生素；

還有就是無血清培養(yǎng)時建議zuihao不加雙抗，因為沒有血清的保護(hù)，細(xì)胞此時是比較脆弱的，很容易受到雙抗的毒副作用影響。

加雙抗并不是*除菌的方法。要防止污染除了使用雙抗，還要注意污染源大多來自換液和消化時的操作不正規(guī)，如果你在處理細(xì)胞得操作過程不規(guī)范，即便加入雙抗也很難避免污染。就像抵抗力再強(qiáng)的漢紙，如果任由自己在寒風(fēng)中、雨雪天氣里任性，像一顆海草隨風(fēng)飄搖的話，終有崩潰的一天。所以保證細(xì)胞處理過程或培養(yǎng)基配制過程中的無菌操作才是關(guān)鍵。

★CQ★解答三

>> 不是所有的細(xì)胞污染都用相同的解決辦法

很多實驗室在遇到細(xì)胞污染，準(zhǔn)確的說是懷疑細(xì)胞受到污染（原因不明導(dǎo)致的細(xì)胞狀態(tài)不好）時，都會選擇一種處理方式——扔掉！害怕他會傳染到其他的細(xì)胞，但是往往你們?nèi)拥舻氖?ldquo;受害者”，而沒找到“真兇”。

并不是所有的細(xì)胞污染都能用扔掉解決，也并不是所有的細(xì)胞污染都可以用同一種試劑解決。

辨別細(xì)胞狀態(tài)，找到根源，“對癥下藥”才是關(guān)鍵。

（1）細(xì)菌污染 

狀態(tài)：細(xì)菌在普通倒置顯微鏡下為黑色細(xì)沙狀，根據(jù)感染細(xì)菌的不同，可有不同的外形，培養(yǎng)液一般會渾濁變黃，對細(xì)胞生長影響明顯。 

解決方法： 

1.仔細(xì)檢查一下器皿的滅菌情況，是否在高壓滅菌時放氣時間和壓力足夠！尤其是和儲存培養(yǎng)液接觸的移液管等物品，連續(xù)兩次污染的話有可能造成儲存液污染，一定要檢查培養(yǎng)液是否存在渾濁現(xiàn)象！ 

2.可在培養(yǎng)液或血清中加支原體預(yù)防劑，以及的細(xì)菌清除劑。 

（2）霉菌及真菌污染 

狀態(tài)：肉眼觀察培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基顏色基本無變化，不渾濁，但是培養(yǎng)基中由絮狀漂浮物，顯微鏡下觀察，若感染真菌可看到分叉細(xì)絲狀的結(jié)構(gòu)（不同種類結(jié)構(gòu)不同），若感染霉菌，顯微鏡下可看到片狀的結(jié)構(gòu)，不透明，真菌及霉菌對影響細(xì)胞的生長影響不大。 

解決方法： 

1.保證細(xì)胞房的干凈整潔，干燥的環(huán)境(潮濕的環(huán)境利于霉菌及真菌的生長)。 

2.控制外來人員進(jìn)出實驗室。 

3.對實驗室及培養(yǎng)箱進(jìn)行*消毒，推薦使用專門針對細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的抑菌劑。 

4.若細(xì)胞非常珍貴，且不易獲得，可以對污染的細(xì)胞采取如下操作。 

懸浮細(xì)胞：收集細(xì)胞并離心，用PBS漂洗，重復(fù)此操作數(shù)次。貼壁細(xì)胞：用PBS輕輕沖洗細(xì)胞，重復(fù)此操作數(shù)次。加入殺滅真菌

（3）支原體感染 

狀態(tài)：顯微鏡下很難捕捉，培養(yǎng)液一般不會渾濁，國內(nèi)血清很多沒做支原體陰性檢測，而支原體是牛血清中zui常見的微生物之一。而且它不能用過濾的辦法除去。支原體感染細(xì)胞以后，細(xì)胞病變不很明顯，只是生長緩慢，直至慢慢凋亡。 

解決方法： 

>>預(yù)防：實驗室新購買的血清及培養(yǎng)基需檢測是否含有支原體，引進(jìn)的新品種細(xì)胞需做支原體檢測，向培養(yǎng)基中添加支原體預(yù)防劑。 

>>補(bǔ)救：將支原體去除劑與*培養(yǎng)液按1:800～1000比例稀釋，加入細(xì)胞正常培養(yǎng)；并根據(jù)細(xì)胞污染的嚴(yán)重程度，處理3～6次即可*清除細(xì)胞支原體污染問題。 

（4）黑膠蟲污染 

狀態(tài)：可以穿透濾膜，也可以通過空氣傳播，低倍下為黑色點(diǎn)狀，高倍鏡下可看見黑色的小蟲游來游去，培養(yǎng)液不渾濁，一般不會太影響，細(xì)胞還可以用。常常可在同一批號的血清養(yǎng)的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象。

解決方法：

加入黑膠蟲去除劑，改變培養(yǎng)基的品牌。血清凍融采取逐級凍融等方法。

（5）桿菌污染

狀態(tài)：類芽孢桿菌（Paenibacillus Ash,Priest&Collin,1994）呈桿狀，革蘭氏染色陽性、陰性或可變，以周生鞭毛運(yùn)動。當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)類芽孢桿菌污染，會在顯微鏡下看到一些桿狀游動的小蟲子.

解決方法：

a. 發(fā)現(xiàn)細(xì)胞有桿菌污染，棄掉培養(yǎng)基，用PBS清洗3遍；

b. 然后按1:2000 比例加入類芽孢桿菌去除劑，即：邊加邊搖勻；

c. 每天處理一次，類芽孢桿菌去除劑連續(xù)處理3-4天，即可*清除桿菌污染。

除以上污染源外，配液消毒問題、操作問題也是污染原因之一。關(guān)于培養(yǎng)基的無菌狀況，取培養(yǎng)基至培養(yǎng)瓶中（不加細(xì)胞），37℃試培養(yǎng)一段時間后觀察，如果沒有細(xì)菌生長就是操作及細(xì)胞培養(yǎng)箱環(huán)境的問題。 

★CQ★TIPs：細(xì)胞操作及細(xì)胞培養(yǎng)箱環(huán)境問題如何解決？ 

1、提高細(xì)胞操作技巧，禁止交叉使用槍頭，在酒精燈火焰5公分距離內(nèi)操作。 

2、定期對細(xì)胞培養(yǎng)箱消毒，培養(yǎng)箱水盤中的水也要定期更換，并使用無菌水。 

3、進(jìn)入細(xì)胞房之前及在無菌操作臺操作細(xì)胞實驗之前需使用紫外燈照射30min。定期使用細(xì)胞房除菌劑對細(xì)胞房空間進(jìn)行處理。

4、每次開培養(yǎng)箱之前需用酒精消毒雙手。 

5、用培養(yǎng)箱除菌劑和水盤抑菌劑定期對培養(yǎng)箱進(jìn)行消毒。 

6、配制的培養(yǎng)基需驗證無菌后方可進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。