冷凍保存細胞之法

1.DMSO之等級和無菌過濾之方式為何？
冷凍保存使用的DMSO等級，必須為Tissueculturegrade的DMSO(如SigmaD2650)，其本身即為無菌狀況，*次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，保存于4°C，避免反復冷凍解凍造成DMSO之裂解而釋出有害物質，并可減少污染之機會。若要過濾DMSO，則須使用耐DMSO之Nylon材質濾膜。
 
2.冷凍保存細胞之方法？
冷凍保存方法一:冷凍管置于4°C30-0分鐘→(-20°C30分鐘*)→-80°C16~18小時(或隔夜)→液氮槽vaporphase長期儲存。冷凍保存方法二:冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3°C至–80 °C以下，再放入液氮槽vaporphase長期儲存。*-20°C不可超過1小時，以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80°C冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
 
3.細胞欲冷凍保存時，細胞冷凍管內應有多少細胞濃度？
冷凍管內細胞數(shù)目一般為1x106cells/mlvial，融合瘤細胞則以5x106cells/mlvial為宜。
 
4. 應如何避免細胞污染？
細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無菌操作技術、清潔的環(huán)境、與品質良好之細胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染之方法。
 
5.如果細胞發(fā)生微生物污染時，應如何處理？
直接滅菌后丟棄之。
 
6.支原體(mycoplasma)污染的細胞，是否能以肉眼觀察出異狀？
不能。
除極有經(jīng)驗之專家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細胞株，無法以其外觀分辨之。
 
7.支原體污染會對細胞培養(yǎng)有何影響？
支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數(shù)，代謝及研究之任一數(shù)據(jù)。故進行實驗前，必須確認細胞為mycoplasma-free，實驗結果之數(shù)據(jù)方有意義。
 
8.偵測出細胞株有支原體污染時，該如何處理？
直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細胞株。
 
9.CO2培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔？
定期(至少每兩周一次)以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。
 
10.為何培養(yǎng)基保存于4°C冰箱中，顏色會偏暗紅色，且pH值會越來越偏堿性？
培養(yǎng)基保存于4°C冰箱中，培養(yǎng)基內之CO2會逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑(通常為phenolred)的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結果，將造成細胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時，可以通入無菌過濾之CO2，以調整pH值。或加入稀鹽酸調整PH值。