傳代細胞培養

什么是傳代細胞培養？

原代細胞或細胞株或細胞系需在體外持續地培養就必須傳代，以便獲得穩定的原代細胞或細胞株或細胞系或得到大量的同種細胞，并維持細胞種的延續，這個過程體外培養稱為傳代細胞培養。一般認為，細胞培養形成單層匯合，細胞密度與生存空間有密切的關系，將培養細胞分散，以1:2或l:3或1:4以上的比率轉移分散進行培養，即為傳代細胞培養。細胞傳代后，一般經過三個階段：游離期、指數增生期和停止期。

常用細胞分裂指數表示細胞增殖的旺盛程度，即細胞群的分裂相數／100個細胞。一般細胞分裂指數介于0.2％～0.5％，腫瘤細胞可達3～5％。細胞接種2～3天分裂增殖旺盛，是活力時期，稱指數增生期(對數生長期)，適宜進行各種試驗。

一、傳代細胞的傳代培養

（1）吸除或倒掉原瓶中的舊培養基（以25mL培養瓶為例）。

（2）每瓶加入2mL,無鈣、鎂PBS，漂洗一次后倒掉。

（3）每瓶加入1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.02%EDTA或混合液），輕輕搖動培養瓶，經消化液鋪滿所有細胞表面，待細胞層略有松動，肉眼可觀察到“薄膜”現象時，倒掉消化液，再繼續作用2~3分鐘，輕輕搖動，細胞層可隨殘留的消化液呈片狀從瓶壁上脫落下來，在顯微鏡下可發現細胞回縮變圓，細胞間隙增大，此時應立即終止消化。

（4）加入*培養基5mL，用吸管反復吹打瓶壁上的細胞，吹打時要按順序進行，以確保所有瓶壁均吹打到，吹打時動作要輕柔，不要用力過大，盡可能不要出現泡沫，以避免細胞的機械損傷。

（5）用計數板計數，計算細胞的濃度，并用培養基調整適當的細胞濃度后再分瓶培養。

二、傳代細胞的建系和維持

1、細胞檔案

細胞檔案要記錄好，如組織來源、生物學特性（由形態、生長繁殖曲線、染色體核型情況、代謝特性、分化特性、病毒敏感性、致瘤特性、有無支原體和潛存病毒等）、培養基的要求、傳代換液時間、擴增時間（分裂指數），細胞的特殊遺傳標志（標記染色體）等，這些記錄對于保證細胞的正常生長，保持細胞的一致和經長期培養細胞特性的變異比較，都有十分重要的意義。

2、換液傳代

（1）細胞系的傳代、換液方法與前相同，但一般都有自身的規律性，因而在繼續傳代時，要注意保持其穩定的規律性，這樣可以減少由于傳代時細胞密度的頻繁增減或換液時間的不規律而導致細胞生長特性的改變，給以后的實驗帶來影響。

（2）多種細胞系維持傳代，要嚴格操作程序，對所用的試劑各系不能交叉。每傳5代后，細胞種子均應凍存。傳代時均應作好記錄，培養瓶上要有明顯標記，標記細胞系名稱和傳代的代數及傳代時間。細胞種子的及時凍存不僅可防止污染丟失，而且還可防止因盲目傳代而造成細胞變異，此外還可提供不同代次的細胞同時進行對比試驗。